Retroincrocio nel breeding della cannabis – scelta dei genitori, linkage drag e limiti del metodo

Portare un carattere da una linea estranea in una varietà esistente senza perdere la varietà: per questo esiste il metodo, e il calcolo che lo sostiene è semplice. Le due condizioni in cui vale non compaiono nella maggior parte delle guide, e nella cannabis viene spesso a mancare proprio la seconda.

Che cosa promette il calcolo

Dopo ogni retroincrocio sullo stesso genitore, la quota di genoma del donatore si dimezza. Senza alcuna selezione, il valore atteso del genitore ricorrente è del 75,0 % dopo il primo ciclo, 87,5 dopo il secondo, 93,8 dopo il terzo, 96,9 dopo il quarto e 98,4 % dopo il quinto. Per trasferire un singolo gene dominante con il metodo classico servono quindi cinque o più generazioni, se si vuole recuperare il 99 % del genoma di partenza.

Con i marcatori sul genoma di fondo questo numero si può abbassare. Chi a ogni generazione non controlla solo il gene bersaglio, ma anche quanto genoma del donatore porta ancora la singola pianta, se la cava con tre generazioni invece di sei. È questo il vero guadagno del retroincrocio assistito da marcatori, ed è un guadagno di tempo, non di qualità.

Nell’uso tedesco il metodo si chiama Verdrängungszüchtung, cioè selezione per sostituzione. È al suo posto quando un carattere monogenico, per esempio la resistenza di una varietà locale, va unito al complesso di caratteri di una varietà produttiva ma sensibile.

I due presupposti che si leggono di rado

Primo: il genitore ricorrente dovrebbe essere a sua volta una linea omozigote. Se non lo è, segrega anche lui a ogni ciclo, e ciò che ritorna non è la varietà ma un suo campione. Nella cannabis questa è la regola e non l’eccezione: una provenienza a impollinazione libera porta tra il 17 e il 35 % di loci eterozigoti. Un genitore ricorrente omozigote va quindi prima creato, con incroci tra fratelli o con un’autofecondazione indotta chimicamente. Entrambe le vie costano generazioni prima che cominci il primo retroincrocio.

Secondo: il carattere trasferito dovrebbe dipendere da uno o pochi loci. Per un carattere monogenico la selezione è univoca a ogni ciclo. Appena sono coinvolti più loci, la probabilità di trovarli tutti nello stesso individuo cala a ogni gene in più. Per questo il retroincrocio assistito da marcatori è più efficace con uno o pochi geni bersaglio, mentre per un carattere quantitativo è lo strumento sbagliato.

Il linkage drag

Ciò che non scompare è l’intorno immediato del gene bersaglio. Poiché a ogni ciclo si seleziona quell’unico allele, il pezzo di genoma del donatore che gli sta attaccato sopravvive a ogni diluizione: è il linkage drag, il trascinamento da associazione.

Quanto resti grande questo pezzo non dipende dal numero di generazioni, ma da quanto spesso avviene ricombinazione in quel tratto. In una simulazione sul colza il segmento trascinato misurava in media 15,9 milioni di paia di basi dopo il primo retroincrocio e 5,4 milioni dopo il secondo. Dopo tre cicli seguiti da un’autofecondazione, il 98 % del genoma donatore ancora presente proveniva proprio da quell’unico segmento. Se invece il gene bersaglio si trovava in un tratto ricco di ricombinazione, lo stesso pezzo si riduceva a frazioni di una megabase.

Perché nella cannabis pesa di più

La struttura del genoma di questa specie lavora contro il metodo. Su 78 genomi risolti per aplotipo, il linkage disequilibrium scende alla metà del suo valore massimo solo dopo circa 10 kilobasi. È un valore paragonabile a quello di popolazioni selvatiche di soia e riso che si incrociano liberamente, e singole coppie di marcatori restano associate per centinaia di kilobasi, fino all’ordine delle megabasi.

A questo si aggiungono le inversioni. In media ogni genoma ne porta 86, la lunghezza media è di 304 kilobasi, le più lunghe arrivano a 25 megabasi. In un tratto invertito tra le due versioni non avviene in pratica alcuno scambio, e ciò che vi si trova migra come un blocco. Il caso più netto nel materiale studiato è un’inversione di 19,5 megabasi sul cromosoma 1 con circa 1203 geni. Tra questi c’è il regolatore della fioritura PRR3, che viene messo in relazione con la fioritura neutra rispetto al giorno. Chi introduce questo carattere con l’incrocio non sposta un gene ma un intero vicinato.

Inoltre in diverse regioni del genoma della cannabis è stata osservata una segregazione distorta: gli alleli di un genitore passano più spesso di quanto il calcolo faccia prevedere. Per un programma di retroincrocio significa che il genoma di fondo non ritorna ovunque con la stessa velocità.

Il caso misurato: il locus del chemotipo

L’introgressione più nota di questo tipo riguarda proprio questo punto. Le linee di canapa ricche di CBD, da cui proviene tra l’altro il genoma di riferimento CBDRx, sono nate introducendo con l’incrocio il tratto CBDAS in un genoma di fondo per lo più di tipo da droga. Lo scopo era unire l’alta genetica di resa delle linee da droga a un chemotipo CBD.

Il tratto in questione è un cattivo candidato per una separazione pulita. Ogni genoma aploide porta al massimo una copia completa di THCAS o di CBDAS, inserita in cassette conservate di elementi trasponibili da 70 a 80 kilobasi, di solito insieme a copie di pseudogeni della stessa famiglia. Queste cassette compaiono solo in poche disposizioni fisse e non stanno nello stesso punto nei diversi tipi d’uso. Sono legate a inversioni, ma nel complesso sono raccolte sul cromosoma 7, in una zona di circa 1,5 megabasi. La mappatura ottenuta incrociando un tipo da droga con una varietà di canapa non ha trovato, tra 99 discendenti, un solo evento di ricombinazione nel blocco CBDAS.

In pratica significa questo: chi introduce il chemotipo con l’incrocio introduce anche la cassetta, e la selezione non riesce a scomporla. Che la segregazione del chemotipo segua comunque il semplice modello a un locus dipende dalla stessa causa. Non è il segno di un carattere dalla struttura semplice.

Che cosa non misura il valore percentuale

La quota di genoma parentale recuperato si misura di solito con marcatori a singolo nucleotide, e in questa specie la loro eterozigosi sta tra l'1 e il 2,5 %. Se si aggiungono le varianti strutturali e i tratti che tra due aplotipi non si possono nemmeno allineare, in media il 20,6 % della lunghezza del genoma è variabile. Un genoma di fondo che secondo i marcatori sembra tornato al 98 % può differire proprio nelle zone che nessun marcatore copre.

Un secondo caso limite riguarda la scelta del donatore. L’indice di fissazione tra tipo da droga e canapa è di 0,20, un valore che altrimenti si trova tra specie diverse. Un incrocio su questa distanza può non solo non aumentare il vigore, ma addirittura ridurlo. La domanda su quanto il donatore possa essere lontano dal genitore ricorrente non è quindi accademica.