Segregazione in F1, F2 e F3 – combinazioni di caratteri nelle prime generazioni di incrocio

Un incrocio dà una prima generazione filiale uniforme solo se entrambi i genitori sono omozigoti per i caratteri considerati. Omozigote significa che il genitore porta due volte la stessa variante nel punto del genoma in questione. Nella cannabis questo non succede praticamente mai. La specie si impollina in modo incrociato invece che da sé, per cui porta due varianti diverse in moltissimi punti. Ciò che si vende come ibrido deriva per lo più dall’incrocio di due piante di questo tipo. Una progenie disomogenea non è quindi un incidente del singolo lotto, ma la conseguenza inevitabile della situazione di partenza. Chi vuole cambiare le cose non può evitare circa sei generazioni di inbreeding, e il resto di questo articolo ne fa i conti.

Da cosa dipende l’uniformità della prima generazione

L’aspettativa deriva dalle leggi di Mendel, cioè dalla legge dell’uniformità e da quella della segregazione. Se si incrociano due linee omozigoti che differiscono per un carattere, la prima generazione filiale è uniforme e solo la seconda segrega. L’enunciato è corretto, ma ha una condizione, e questa sta proprio all’inizio: entrambi i genitori devono essere omozigoti.

Nel mais questa condizione si può creare. Lì fiori maschili e femminili stanno sulla stessa pianta, che quindi può impollinarsi da sola. Nel corso di più generazioni di questo tipo nascono linee consanguinee diverse tra loro, ma ciascuna omozigote. I punti del genoma considerati si chiamano loci, e ogni linea vi porta due volte la stessa variante. Per questo l’incrocio di due linee precise dà sempre lo stesso risultato. Questa ripetibilità è il vero guadagno, non il vigore della progenie.

La cannabis è per lo più dioica: fiori maschili e femminili stanno di solito su piante separate. Di solito però non vuol dire sempre. Sulle piante femminili compaiono spontaneamente fiori maschili, e allora la pianta si impollina da sola senza alcun intervento. Solo che non lo si può pianificare, perché quale pianta cambia e quando non lo decide l’allevatore. Chi vuole autofecondare una pianta precisa ha quindi bisogno di un intervento, descritto più avanti.

Quanto una linea possa restare lontana da questo traguardo, pur essendo stata lavorata, lo mostra il classico studio sul chemotipo con il proprio materiale. Lo studio usava linee già sottoposte due volte a inbreeding e le controllava con marcatori, cioè punti del genoma che in laboratorio si leggono senza ambiguità. Ciononostante, a seconda della combinazione, tra il 5,6 e il 37,5 % di questi punti erano ancora misti e segregavano già nella prima generazione filiale.

Per una varietà commerciale un numero del genere non esiste. L’omozigosi non si vede guardando una pianta: la si misura con i marcatori o la si verifica sulla progenie. Il fatto che una varietà abbia lo stesso aspetto da anni non è né l’una né l’altra cosa.

La regola dei tre quarti e la sua portata

Tre a uno descrive esattamente un carattere a cui partecipano due versioni di una variante. Una si impone, l’altra viene da essa coperta. Appena entrano in gioco più punti di questo tipo, le quote si moltiplicano: con due caratteri il quadro voluto compare ancora nel 56 % delle piante, con tre nel 42 %, con dieci nel 5,6 %. Per fissare il carattere conta però un altro numero. Solo un quarto per punto porta due volte la variante desiderata, e con tre caratteri questo significa l'1,6 % delle piante.

Questa quota non decide le probabilità di successo, ma il numero di piante. Per trovarne almeno una adatta con una sicurezza del 99 %, con tre caratteri obiettivo servono circa 290 plantule. Combinare in modo pulito due proprietà è quindi un compito alla portata di una normale stanza di selezione. Cinque insieme falliscono per lo spazio disponibile, non per mancanza di conoscenze.

Il chemotipo: un carattere in un solo punto

Un carattere si comporta in modo diverso, e il caso opposto è istruttivo. Se una pianta produce soprattutto THC o soprattutto CBD lo decide un solo punto del genoma. Ogni pianta possiede due copie di questo punto, una dal padre e una dalla madre. Su ciascuna si trova la variante per il THC oppure quella per il CBD. Ne risultano tre tipi di piante: due volte THC danno THC puro, due volte CBD danno CBD puro, una di ciascuna dà una pianta che produce entrambi. Nessuna delle due varianti copre l’altra.

Per questo qui si può calcolare in anticipo cosa darà un incrocio. Se si incrociano due piante che producono entrambi i composti, ogni genitore trasmette a caso una delle sue due varianti. Il 25 % dei discendenti produce THC puro, il 50 % entrambi, il 25 % CBD puro. In dieci progenie esaminate della seconda generazione filiale, con 35–118 piante ciascuna, è risultato proprio questo rapporto (in letteratura 1:2:1).

Questa è l’eccezione e non la regola. Aroma e resa non dipendono da un solo punto, ma da molti insieme, e per loro non ci sono né tre tipi né una quota nota in anticipo. La differenza nella pratica è questa. Con il chemotipo un allevatore sa prima della semina quanti semi deve mettere per ottenere una certa pianta. Con l’aroma coltiva, controlla ogni pianta singolarmente e tiene quelle adatte.

Dalla singola pianta alla linea pura

Ottenere una generazione successiva da una singola pianta selezionata è possibile solo con il suo stesso polline. In modo controllato ci si arriva con l’inversione sessuale indotta. Le piante femminili, dopo un trattamento con tiosolfato d’argento, formano fiori maschili fertili; quelle maschili, dopo un trattamento con ethephon, fiori femminili.

Il nome della generazione che nasce dipende da cosa era la pianta autofecondata. Se era la F1 dell’incrocio di due genitori, la sua progenie è la F2, cioè la seconda generazione filiale di quell’incrocio. Se era una singola pianta qualsiasi, si contano i cicli di autofecondazione: S1 dopo il primo, S2 dopo il secondo, e così via. Il classico lavoro sul chemotipo ha condotto entrambe le serie e per entrambe ha usato la stessa inversione sessuale.

Per una linea omozigote, invece, il selfing non è l’unica via, ma la più rapida di due. L’altra è l’incrocio tra fratelli, cioè l’accoppiamento di due piante della stessa progenie. Richiede piante maschili e quindi semi regolari, e arriva alla meta più lentamente. Il ritmo più lento ha un rovescio che non compare nel calcolo dei tempi. A parità di grado di inbreeding, l’incrocio tra fratelli elimina meglio le varianti che risultano letali in doppia copia. Nel modello restano 7,11 varianti di questo tipo, contro 9,3 con il selfing. Il modello descrive popolazioni naturali, per cui è trasferibile il meccanismo e non il numero. Inoltre ogni ciclo di selfing richiede l’inversione sessuale e seleziona così anche la capacità di farla. Questo aumenta nella linea finita il rischio di fiori maschili indesiderati.

Un singolo ciclo di selfing porta tra l’altro il contrario di ciò che ci si aspetta. Nel confronto diretto con due incroci su un’altra pianta, i discendenti da selfing raggiungevano circa metà dell’altezza e metà della superficie fogliare. Fiorivano sette giorni più tardi e davano il 63 % in meno di massa secca di cime. Per massa totale e massa delle cime la loro dispersione era da due a tre volte quella del gruppo di confronto. Un ciclo di selfing non uniforma nulla: mette allo scoperto ciò che prima era coperto.

L’uniformità arriva solo alla fine del percorso. Con la discendenza da seme singolo, in cui a ogni generazione si porta avanti una sola pianta, servono circa sei generazioni perché la quota di punti misti scenda sotto il 3 %. Il punto di partenza è il 17–35 % nelle piante iniziali a impollinazione libera. Il prezzo è scritto nello stesso lavoro. La quota di fiori anomali è salita dallo 0,4 % della generazione di partenza al 13,7 % della sesta, cioè a più di trenta volte tanto. Solo l’incrocio di due linee di questo tipo dà la progenie uniforme che ci si aspetta da una F1. Anche lì, solo due linee ibride su cinque sono rimaste entro il 20 % di variazione per tutti i principi attivi misurati. Con questo il calcolo dell’apertura è completo. L’uniformità si può raggiungere, ma è un progetto di sei generazioni e non una qualità che un buon incrocio porta con sé.

Retroincrocio e i dintorni del gene obiettivo

Il retroincrocio è considerato una scorciatoia quando un singolo carattere deve entrare in una varietà esistente. In teoria, dopo un ciclo il 75 % del genoma torna a provenire dal genitore che ritorna in ogni ciclo, in letteratura genitore ricorrente. Dopo il secondo ciclo la quota è dell'87,5 %, dopo il terzo del 93,8 %. Per un recupero quasi completo servono cinque cicli o più. Due condizioni vengono taciute quasi sempre. Questo genitore ricorrente dovrebbe essere a sua volta una linea omozigote, e il carattere trasferito dovrebbe dipendere da uno o pochi punti. La prima condizione riporta dritto all’affermazione iniziale.

Ciò che non sparisce è l’immediato intorno della variante obiettivo. In ogni ciclo si scelgono le piante che portano proprio questa variante, per cui le resta attaccato un pezzo del genoma estraneo: il linkage drag. In una simulazione sulla colza questo pezzo misurava 15,9 milioni di paia di basi dopo il primo retroincrocio e 5,4 milioni dopo il secondo. Dopo tre cicli seguiti da autofecondazione, il 98 % del genoma estraneo rimasto proveniva da questo unico pezzo. La posizione di una variante decide quindi il successo più del numero di generazioni.

Resta il caso particolare che nessuno pianifica: discendenti che stanno fuori dall’intervallo di entrambi i genitori. Non nascono di preferenza da genitori il più possibile diversi. In sei incroci di riso, solo quello tra due varietà con fioritura quasi uguale ha mostrato una forte dispersione. Lì l’intervallo era di 18 giorni, con una differenza tra i genitori di 0,7 giorni. Per la cannabis non è stato studiato, ma come aspettativa vale comunque. Gli outlier sgradevoli e quelli graditi nascono dallo stesso meccanismo, ed entrambi compaiono dove meno li si aspetta.